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穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建---高產(chǎn)細(xì)胞株的秘密
日期：2025-04-26 03:10
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摘要：
穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建---高產(chǎn)細(xì)胞株的秘密
生物制藥行業(yè)在*近20年發(fā)展迅速，特別是基于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品市場份額不斷擴(kuò)大。哺乳動物細(xì)胞（如CHO）的生產(chǎn)工藝開發(fā)過程通常包括分子構(gòu)建、穩(wěn)定細(xì)胞株篩選、上游發(fā)酵工藝開發(fā)、下游純化工藝開發(fā)以及制劑工藝的開發(fā)。在這些階段中，分子構(gòu)建和穩(wěn)定細(xì)胞株篩選做為一個產(chǎn)品研發(fā)的起始部分，顯得極為重要。一株穩(wěn)定高產(chǎn)的工程細(xì)胞株不僅能顯著增加單位體積產(chǎn)量，降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，并且還可以降低下游純化過程的復(fù)雜度，確保獲得**，高品質(zhì)的生物制品。
生物制藥行業(yè)在*近20年發(fā)展迅速，特別是基于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品市場份額不斷擴(kuò)大。哺乳動物細(xì)胞（如CHO）的生產(chǎn)工藝開發(fā)過程通常包括分子構(gòu)建、穩(wěn)定細(xì)胞株篩選、上游發(fā)酵工藝開發(fā)、下游純化工藝開發(fā)以及制劑工藝的開發(fā)。在這些階段中，分子構(gòu)建和穩(wěn)定細(xì)胞株篩選做為一個產(chǎn)品研發(fā)的起始部分，顯得極為重要。一株穩(wěn)定高產(chǎn)的工程細(xì)胞株不僅能顯著增加單位體積產(chǎn)量，降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，并且還可以降低下游純化過程的復(fù)雜度，確保獲得**，高品質(zhì)的生物制品。
宿主細(xì)胞與重組蛋白生產(chǎn)
動物細(xì)胞是生產(chǎn)治療性重組蛋白的強(qiáng)有力工具。為與小分子藥物區(qū)別開來，治療性蛋白、疫苗以及細(xì)胞治療產(chǎn)品統(tǒng)稱為生物制品。宿主細(xì)胞的選擇和改造對于提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量來說至關(guān)重要。因此必須對細(xì)胞進(jìn)行篩選，選出具有高表達(dá)量和良好生長特性的細(xì)胞。在此我們主要討論適用于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的細(xì)胞株的篩選。
工業(yè)上重組蛋白的制備主要有兩種方式：瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染經(jīng)常用于制備少量蛋白（多達(dá)克級）用于藥物開發(fā)早期的蛋白活性或動物實驗。瞬時轉(zhuǎn)染并不產(chǎn)生克隆細(xì)胞株，它只是暫時將編碼外源蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入已有的細(xì)胞株里面（比如HEK293或COS細(xì)胞）。隨著細(xì)胞的分裂外源基因不斷丟失，蛋白產(chǎn)量較低，一般在1-100mg/L。近年來有報道稱HEK293細(xì)胞中瞬時表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)1g/L。
與瞬時轉(zhuǎn)染不同，穩(wěn)定細(xì)胞株是為工業(yè)化生產(chǎn)治療性蛋白而構(gòu)建的。穩(wěn)定細(xì)胞株需要具備在不同的時間，不同的場地以及不同的批次間生產(chǎn)相同質(zhì)量產(chǎn)品的能力。在選定生產(chǎn)用細(xì)胞株之后，需要建立主細(xì)胞庫（mater cell bank）。從主細(xì)胞庫復(fù)蘇后，擴(kuò)增建立工作細(xì)胞庫（working cell bank），工作細(xì)胞庫用于生產(chǎn)。細(xì)胞庫通常保存在液氮中，需要維持整個產(chǎn)品的生命周期。在構(gòu)建生產(chǎn)用細(xì)胞株的過程中，宿主細(xì)胞和表達(dá)載體至關(guān)重要。
穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建---高產(chǎn)細(xì)胞株的秘密
CHO和骨髓瘤細(xì)胞是構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株*常用的兩種宿主細(xì)胞。基本上用這兩類細(xì)胞生產(chǎn)的治療性蛋白都能分泌到細(xì)胞外，從而可以從細(xì)胞培養(yǎng)液中收獲產(chǎn)物。 CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，是一種非分泌型細(xì)胞，它本身很少分泌內(nèi)源蛋白。
科研人員在蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上研究了B細(xì)胞變成漿細(xì)胞所發(fā)生的生理變化。細(xì)胞轉(zhuǎn)變提高了能量代謝水平，改善了蛋白分泌和糖基化能力，同時增加了氧化還原水平用來應(yīng)對活性氧的影響。B細(xì)胞或漿細(xì)胞的基因組中只有一個功能性的免疫球蛋白基因。在B細(xì)胞成熟的過程中，二倍體細(xì)胞中其中一個等位基因發(fā)生失活。但是，僅僅是免疫球蛋白基因的一個拷貝足以使?jié){細(xì)胞成為一個高產(chǎn)的分泌細(xì)胞。因此，只需將目的基因的一個拷貝整合到雜交瘤細(xì)胞基因組適合的位置就可以使其成為分泌外源蛋白的強(qiáng)大細(xì)胞。與瘤細(xì)胞不同，CHO必須經(jīng)過改造后才能提升蛋白表達(dá)能力。
除了蛋白表達(dá)能力之外，優(yōu)良的細(xì)胞株還應(yīng)具備良好的生長和代謝特性。在過去的十多年里，大量轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究致力于揭示高產(chǎn)細(xì)胞株的特性。人們逐漸意識到?jīng)]有那一種主要的調(diào)控因素能使CHO或NS0來源的重組細(xì)胞變成高產(chǎn)細(xì)胞株。高產(chǎn)細(xì)胞株的形成涉及細(xì)胞內(nèi)許多通路的改變，比如代謝、分泌、氧化還原平衡和生長/死亡調(diào)控；更可能的是大量基因表達(dá)水平的微小變化，而不是幾個主要節(jié)點的大變化。
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